СРАВНЕНИЕ СПОНТАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ СЕЛЕКЦИОНИРОВАННЫХ ШТАММОВ ASPERGILLUS NIGER V. TIEGH - ПРОДУЦЕНТОВ АЛЛЕРГЕНОВ ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ МАРКЕРАМ В МНОГОСТУПЕНЧАТОЙ СЕЛЕКЦИИ (THE CMPARISON OF SPONTANEOUS VARIABILITY OF SELECTED ASPERGILLUS NIGER V. TIEGH STRAIN)

Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Васильева Н.В., Фролова Е.В., Соловьева Г.И.
Zhuravleva N.P., Yelinov N.P., Vasilyeva N.V., Frolova E.V., Solovjova G.I.

Author address: 

НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I.Mechnikov, St.Petersburg, Russia

Abstract: 

THE COMPARISON OF SPONTANEOUS VARIABILITY OF SELECTED ASPERGILLUS NIGER V. TIEGH STRAINS - PRODUCENTS OF ALLERGENS ON BIOLOGICAL MARKERS IN MULTISTEP SELECTION

Сегодня на сайте грибов зарегистрировано всего 105 аллергенов. Среди них у Aspergillus niger выявлено 3. Известно, что аллергены A. niger сенсибилизируют макроорганизмы, вызывая заболевания органов дыхания человека, в том числе - аллергический бронхолегочный аспергиллез (АБЛА) и бронхиальную астму, рино-синуситы.

Весьма важно, при этом, изучение изменчивости популяций штаммов A. niger как этиологического агента аллергических заболеваний, что необходимо для диагностики микогенной сенсибилизации. Своеобразие клинических проявлений соответствующих заболеваний может зависеть от смены фенотипов различных видов грибов. В связи с этой проблемой актуальным является получение высокоактивных, стандартных и специфических штаммов A. niger для использования их в технологии создания специфических и стандартных отечественных препаратов для микоаллергодиагностики.

Цель исследования - изучение спонтанной изменчивости селекционированных штаммов A. niger при многоступенчатой селекции по двум маркерам: типичных морфологических колоний (МК) и активности прорастания конидий (ПК).

Материалы и методы. Объекты исследования - 3 селекционированных штамма (СШ) A. niger. Генеалогия: ранее нами изучен штамм РКПГ-967, выделенный из промывных вод бронхов от больного АБЛА. При изучении естественной изменчивости популяции этого штамма по 2-м маркерам (типичности МК и активности ПК) были селекционированы штаммы (СШ) №967/10, на следующей ступени - штамм №967/10/7 и далее - №967/10/7/49, т.е. 3 выше представленных штамма были отобраны при многоступенчатой селекции также по 2-м маркерам - типичности МК и интенсивности ПК. При этом использовали метод прикладной генетики и селекции -    отбор клонов из моноспорового рассева популяции изучаемых штаммов. Рассев штаммов производили на агаризованной модифицированной нами среде Чапека Докса с 2% глюкозы. Выращивали в термостате при 28 оС в течение 7 суток. По маркеру типичности морфологии колоний изучали по 500 клонов каждого штамма. Затем типичные по МК изучали по маркеру интенсивности ПК. Для этого колонии выращивали в жидкой среде Сабуро с 4% глюкозы с добавлением дрожжевого экстракта и постоянном встряхивании на шуттель аппарате в течение 10 часов при 27 оС. Для оценки активности ПК просматривали, в среднем, 100 клонов каждого штамма. Количество ПК подсчитывали в процентах к общему числу конидий в 10 полях зрения микроскопа МБИ-15. С целью отбора высокоактивных вариантов по интенсивности ПК провели статистическую обработку данных по «методу сумм» (Плохинского). Селекционированные высокоактивные штаммы по ПК и типичные по МК проверяли на стабильность в ряде генераций.

Результаты. При исследовании СШ на разных ступенях селекции по маркеру МК выявили гомогенность клонов в популяциях. Так, популяции представлены одним типом колоний - 3 см в диаметре, с черным воздушным мицелием. Субстратный мицелий - компактный, светло-желтый, погруженный. Конидиальные головки - 700 мкм в диаметре, конидиеносцы варьируют до 3 см высотой, неокрашенные конидии - шаровидные, 4-5 мкм в диаметре, коричневые, шероховатые, реверзум желтый.

Для изучения спонтанной изменчивости клонов в популяциях СШ по маркеру ПК использовали критерии вариабельности. Выявили, что с каждой последующей ступенью селекции критерии изменчивости возрастали. Так, на I-ой ступени - размах изменчивости был от 0 до 80%, а на II и III - увеличился на 20% (от 0 до100%). С каждой ступенью отбора модальный класс по ПК сдвигался в интервал высокоактивных вариантов. Так, на I-ой ступени - от 20 до 40%, на II-ой - от 60 до 80%, а на третьей - от 80 до 100%. Кроме того, на I ступени отмечали большое количество низкоактивных вариантов до 46,5%, а на II и III ступенях был значительно снижен процент низкоактивных клонов - до 6 и 0% соответственно. При этом количество высокоактивных клонов в популяциях штаммов на II и III ступенях селекции увеличилось в сравнении с I-ой ступенью на 14 и 56%. Интенсивность ПК на III ступени увеличилась на 47,7% в сравнении с I-ой, т.е. в 2,2 раза. Количество «плюс» - вариантов на II и III ступени также возросло значительно - в 8 раз в сравнении с I-ой ступенью, частота их составила 32% - на II и III ступенях селекции и 4% - на I-ой. В результате многоступенчатой селекции выделили 10 высокоактивных штаммов по маркеру ПК от 80 до 98%.

Штаммы стабильны по маркерам МК и высокоактивны по ПК в ряде генераций. Штаммы входят в банк культур грибов - продуцентов аллергенов и хранятся в коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

Выводы. С применением многоступенчатой селекции изучена естественная изменчивость популяций СШ микромицета Aspergillus niger. Выявлен значительный потенциал жизнеспособности конидий СШ гриба, что проявилось на интенсивности ПК и возрастании активности с увеличением ступеней селекции. В результате получены 10 высокоактивных штаммов с интенсивностью ПК от 80 до 98%. Эти штаммы стабильны по маркерам МК и ПК в ряде генераций и могут быть использованы при создании отечественных тест- систем для аллергодиагностики.

2014

Full conference title: 

RUSSIAN-CHINESE SCIENTIFIC-PRACTICAL CONFERENCE ON MEDICAL MICROBIOLOGY AND CLINICAL MYCOLOGY (XVII KASHKIN READING)
    • All Russian CMMCM XVII