ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК И КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ДНК-МИШЕНИ ASPERGILLUS FUMIGATUS С использованием пцр в режиме «реального времени» (optimization of dna extraction METHODS AND AMPLIFICATION STEP TO FIND DNA-TARGET OF aspergillus fumigatus usin)

Богданов К.В., Игнатьева С.М.
Bogdanov K.V., Igtatieva S.M.

Author address: 

НИИ медицинской микологии им.П.Н.Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО, Санкт-Петербург, Россия
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, SEI APE SPb MAPE, St.Petersburg, Russia

Abstract: 

Optimization of dna extraction METHODS AND AMPLIFICATION STEP TO FIND DNA-TARGET OF aspergillus fumigatus using REAL-TIME Q-PCR.

Диагностика инвазивного аспергиллеза остается проблематичной до настоящего времени. Традиционные культуральные методы исследования, микроскопирование гистологических образцов и иммунодиагностика являются длительными процедурами по времени, трудоемкими или обладают недостаточной чувствительностью. В настоящее время молекулярно-генетические методы анализа и, в частности, количественную оценку ДНК-мишени грибов рода Aspergillus с помощью ПЦР, рассматривают как альтернативные тесты благодаря высокой чувствительности и специфичности. Однако применение количественной оценки ДНК-мишени A. fumigatus для диагностики аспергиллеза и мониторинга больных, получающих химиотерапию, требует оптимизации процедуры выделения ДНК и последующей постановки количественной ПЦР (Q-PCR).

Цель исследования - подобрать оптимальные условия для проведения экстракции ДНК и постановки ПЦР в режиме «реального времени» для количественного определения специфического участка ДНК, кодирующего большую рибосомальную субъединицу 28S A. fumigatus.

Материалы и методы. Экстракцию ДНК из суспензии спор A. fumigatus штамм РКШГ-1076 (Российская коллекция патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. Кашкина), а также из биосубстратов больных аспергиллезом (цельная кровь, плазма, бронхоальвеолярный лаваж) проводили двумя способами. Первый способ включал применение отечественного набора реагентов для выделения ДНК на сорбенте («ДНК Сорб-В», ИнтерЛабСервис, Россия); во втором случае ДНК выделяли на колонках с использованием импортного набора реагентов (DNA minikit, Qiagen, Germany). Амплификацию ДНК-мишени A. fumigatus и р-глобинового гена человека (внутренний контроль выделения геномной ДНК) в режиме «реального времени» с использованием реагентов фирмы «Applied Biosystems» (США) выполняли на термоциклере «Rotor-Gene 6000» (Corbett Research, Австралия). Для определения чувствительности Q-PCR проводили построение калибровочных кривых стандартов, приготовленных на основе разведений спор A. fumigatus (101, 102, 103, 104, 105 клеток/мл) в донорской крови и плазме. Вычисление количества копий ДНК-мишени гриба в исследуемом клиническом образце проводили с помощью прилагаемого к термоциклеру программного обеспечения.

Результаты. Было показано, что ДНК, выделенная двумя вышеназванными способами, удовлетворяла требованиям, необходимым для выполнения Q-PCR и построения кривой стандартов на основе разведений спор A. fumigatus. Чувствительность метода составляла 10 копий ДНК-мишени на реакцию. При анализе результатов амплификации специфического участка р-глобинового гена человека выявили, что выход геномной ДНК, выделенной на сорбенте, был немного выше выхода ДНК, выделенной на колонках. Также было обнаружено, что оба способа выделения ДНК в некоторых случаях приводили к низкому выходу ДНК, экстрагируемой из более плотных биосубстратов больных, например, из бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ). Это, в свою очередь, приводило к снижению чувствительности Q-PCR при выявлении ДНК-мишени A. fumigatus у больных аспергиллезом.

Выводы. Оптимизированный Q-PCR анализ для оценки количества копий ДНК-мишени A. fumigatus можно применять у больных аспергиллезом; чувствительность метода составляет 10 копий ДНК-мишени на реакцию. Способы выделения ДНК на сорбенте или на колонках из биосубстратов боль-ных и суспензии спор гриба подходят для выполнения количественной ПЦР в режиме «реального времени». Для выделения ДНК из БАЛ больных, наряду со встряхиванием образца с бусинами «Баллотини» во время экстракции, требуется дополнительная механическая обработка образца, например, ультразвуковая гомогенизация, способствующая более глубокому лизису клеток, большему выходу ДНК и, в конечном итоге, повышению эффективности Q-PCR.

2010

Full conference title: 

RUSSIAN-CHINESE SCIENTIFIC-PRACTICAL CONFERENCE ON MEDICAL MICROBIOLOGY AND CLINICAL MYCOLOGY (XIIV KASHKIN READING)
    • All Russian CMMCM XIIV