ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОЗОВ С ПОМОщью СИКВЕНИРОВАНИЯ ДНК (IDENTIFICATION OF THE CAuSATIVE AGENT OF MYCOSES uSING DNA sequencing)

Михайлова Ю.В., Руднева М.В., Чилина Г.А., Полищук А.Г.
Mikhaylova Y.V., Rudneva M.V., Chilina G.A., Polishouk A.G.

Author address: 

НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia

Abstract: 

В последней время, в связи с увеличением числа им-мунокомпрометированных пациентов, всё большее распространение получают микотические инфекции. Возбудителями микозов являются как дрожжеподобные грибы (Candida sрp., Cryptococcus neoformans), так и филамен-тирующие микромицеты (Aspergillus sрp., Zygomycetes, Fusarium sрp.). В 2008 г. американским Институтом Клинических и лабораторных стандартов были предложены последовательности рДНК (16S рРНК, ITS) для идентификации с помощью ДНК-сиквенирования клинически значимых бактерий и грибов, однако для однозначной видовой идентификации многих групп микромицетов требуются альтернативные молекулярные мишени, поиск которых продолжается.

Цель работы - видовая идентификация патогенных микромицетов с помощью сиквенирования ДНК и сравнение результатов сиквенирования с результатами идентификации классическими методами.

Материалы и методы. В работе были использованы 55 Candida spp., 8 Cryptococcus spp., 50 Aspergillus spp., 22 зи-гомицета и 12 единичных представителей других родов из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина. Микромицеты культивировали на агаре Сабуро и картофельно-морковном агаре. Сиквенирование проводили по фрагментам рДНК ITS и D1/D2, генов р-тубулина и кальмодулина. Сиквени-рование ДНК выполняли по методу Сэнджера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Bisystems, США) в обоих направлениях. Полученные с помощью программы Variant Reporter 3.1 последовательности анализировали с помощью алгоритма BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Результаты. Определили видовую принадлежность 137 клинических изолятов микромицетов. Из 55 штаммов Candida в 18 случаях (33%) результаты биохимической идентификации и сиквенирования не совпали. Расхождение результатов наблюдали для C. albicans, C. dubliniensis, C. krusei, C. glabrata, C. lipolytica, C. zeylanoides. Два штамма криптококков, определенные фенотипически и биохимически как Cryptococcus albidus, были идентифицированы сиквенированием как С. neoformans, видовая идентификация остальных шести совпала для всех методов. Сик-венирование Aspergillus spp. проводили дополнительно по альтернативной ДНК-мишени - бета-тубулину, поскольку однозначную видовую идентификацию по последовательностям рДНК удалось получить только для A. fumigatus. С помощью фрагмента гена р-тубулина среди изолятов были выявлены виды, трудно дифференцируемые при рутинном морфологическом анализе: A. tubingensis, A. calidoustus A.    sydowii, а также редко встречаемые среди клинических изолятов A. sclerotiorum и A. amstelodami. В 31% случаев результаты фенотипической идентификации и сиквениро-вания Aspergillus spp. не совпали. Для представителей Zygomycetes в большинстве случаев для идентификации было достаточно ITS или D1/D2 фрагментов рДНК, однако для двух изолятов была необходима информация об обеих последовательностях. С помощью молекулярного анализа были идентифицированы четыре изолята, ранее морфологически определённых только до уровня рода.

Заключение. Для однозначной идентификации дрожжеподобных грибов и Zygomycetes можно использовать фрагменты рДНК ITS или D1/D2, тогда как для Aspergillus - участок гена р-тубулина. Результатами исследования подтверждена значительно большая точность видовой идентификации микромицетов с помощью ДНК сиквени-рования по сравнению с точностью классических методов видовой идентификации.

2013

Full conference title: 

RUSSIAN-CHINESE SCIENTIFIC-PRACTICAL CONFERENCE ON MEDICAL MICROBIOLOGY AND CLINICAL MYCOLOGY (XVI KASHKIN READING)
    • All Russian CMMCM XVI